Fungsi enzim sekatan, mekanisme tindakan, jenis dan contoh



The enzim sekatan mereka adalah endonukleases yang digunakan oleh arkea dan bakteria tertentu untuk menghalang atau "menyekat" penyebaran virus di dalamnya. Mereka amat biasa dalam bakteria dan merupakan sebahagian daripada sistem pertahanan mereka terhadap DNA asing yang dikenali sebagai sistem sekatan / pengubahsuaian.

Enzim-enzim ini memangkinkan pemotongan DNA double-stranded di tapak-tapak tertentu, diperbuat semula dan tanpa menggunakan tenaga tambahan. Kebanyakan memerlukan kehadiran cofactors seperti magnesium atau kation divalen lain, walaupun ada juga yang memerlukan ATP atau S-adenosyl methionine.

Endonukleases sekatan ditemui pada tahun 1978 oleh Daniel Nathans, Arber Werner dan Hamilton Smith, yang menerima Hadiah Nobel untuk Perubatan untuk penemuan mereka. Namanya biasanya berasal dari organisma di mana ia diperhatikan untuk kali pertama.

Enzim sedemikian digunakan secara meluas dalam pembangunan kaedah pengklonan DNA dan strategi biologi molekul lain dan strategi kejuruteraan genetik. Ciri-ciri pengiktirafan urutan dan keupayaan untuk memotong urutan yang dekat dengan tapak pengiktirafan menjadikannya alat yang berkuasa dalam eksperimen genetik.

Serpihan yang dihasilkan oleh enzim sekatan yang bertindak ke atas molekul DNA tertentu boleh digunakan untuk mencipta "peta" molekul asal dengan menggunakan maklumat mengenai tapak di mana enzim memotong DNA.

Beberapa enzim sekatan mungkin mempunyai tapak pengenalan yang sama dalam DNA, tetapi mereka tidak semestinya memotongnya dengan cara yang sama. Oleh itu, terdapat enzim yang membuat luka meninggalkan hujung tumpul dan enzim yang dipotong meninggalkan hujung kohesif, yang mempunyai aplikasi yang berlainan dalam biologi molekul.

Pada masa ini terdapat beratus-ratus enzim sekatan yang tersedia secara komersial yang ditawarkan oleh rumah-rumah komersial yang berbeza; enzim ini berfungsi seperti gunting molekul "adat" untuk tujuan yang berbeza.

Indeks

  • 1 Fungsi
  • 2 Mekanisme tindakan
  • 3 jenis
    • 3.1 Jenis enzim sekatan saya
    • 3.2 Jenis II enzim sekatan
    • 3.3 Type III enzim sekatan
    • 3.4 Type IV enzim sekatan
    • 3.5 Type V pembatasan enzim
  • 4 Contoh
  • 5 Rujukan

Fungsi

Enzim sekatan berfungsi fungsi bertentangan polimerase, kerana mereka menghidrolisis atau memecahkan ikatan ester dalam ikatan fosfodiester antara nukleotida bersebelahan dalam rantaian nukleotida.

Dalam biologi molekular dan kejuruteraan genetik mereka digunakan secara meluas alat untuk pembinaan ungkapan dan kloning vektor, serta untuk mengenal pasti urutan tertentu. Mereka juga berguna untuk pembinaan genom rekombinan dan mempunyai potensi bioteknologi yang hebat.

Kemajuan terkini dalam terapi gen membuat penggunaan enzim sekatan semasa untuk memperkenalkan gen tertentu ke dalam vektor yang merupakan kenderaan untuk mengangkut gen tersebut ke sel hidup, dan itu mungkin mempunyai keupayaan untuk dimasukkan ke dalam genom sel untuk melaksanakan perubahan kekal.

Mekanisme tindakan

Enzim sekatan boleh memangkinkan pemotongan DNA double-stranded, walaupun ada yang dapat mengiktiraf urutan DNA terkandas tunggal dan juga RNA. Pemotongan berlaku selepas pengiktirafan urutan.

Mekanisme tindakan terdiri daripada hidrolisis ikatan fosfodiester antara kumpulan fosfat dan deoxyribose di tulang belakang setiap helai DNA. Banyak enzim dapat memotong di tempat yang sama yang mereka kenali, sementara yang lain memotong antara 5 dan 9 pasang asas sebelum atau selepasnya..

Biasanya enzim-enzim ini dipotong pada akhir '5 kumpulan fosfat, menimbulkan serpihan DNA dengan akhir fosforil 5' dan terminal hidroksil akhir 3.

Oleh kerana protein tidak dapat bersentuhan langsung dengan tapak pengiktirafan dalam DNA, ia mesti ditranslasikan secara berturut-turut sehingga mereka mencapai tapak tertentu, mungkin melalui mekanisme "geser" pada helai DNA..

Semasa pemotongan enzimatik, hubungan fosfodiester bagi setiap helai DNA diposisikan dalam salah satu tapak aktif enzim sekatan. Apabila enzim meninggalkan laman pengiktirafan dan pemotongan, ia dilakukan melalui persatuan sementara yang tidak khusus.

Jenis

Pada masa ini, lima jenis enzim sekatan diketahui. Di bawah, penerangan ringkas mengenai setiap:

Jenis enzim sekatan saya

Enzim-enzim ini adalah protein pentamerik besar dengan tiga subunit, sekatan, metilasi dan satu lagi untuk pengiktirafan urutan DNA. Endonukleases ini adalah protein pelbagai fungsi yang boleh memangkinkan sekatan dan pengubahsuaian, mereka mempunyai aktiviti ATPase dan juga topoisomerase DNA.

Enzim jenis ini adalah endonukleases pertama yang dapat ditemui, mereka telah disucikan untuk kali pertama pada tahun 1960-an dan sejak itu mereka telah dikaji dengan kedalaman yang besar.

Jenis I enzim tidak digunakan secara meluas sebagai alat bioteknologi, memandangkan tapak pemotongan boleh berada pada jarak variasi sehingga 1,000 pasang asas dari tapak pengiktirafan, yang menjadikannya tidak boleh dipercayai dari segi kebolehulangan percubaan.

Enzim sekatan jenis II

Mereka adalah enzim yang terdiri daripada homodimer atau tetramer yang memotong DNA di tapak yang ditentukan antara 4 dan 8 bp panjangnya. Laman-laman pemotongan ini biasanya palindromic, iaitu, mereka mengiktiraf urutan yang dibaca dengan cara yang sama di kedua-dua arah.

Banyak enzim sekatan jenis II dalam bakteria memotong DNA apabila mereka mengenali watak asing mereka, kerana mereka tidak mempunyai modifikasi biasa yang mempunyai DNA yang sepatutnya..

Ini adalah enzim sekatan yang paling mudah kerana mereka tidak memerlukan apa-apa cofactor selain magnesium (Mg +) untuk mengenali dan memotong urutan DNA.

Ketepatan enzim sekatan jenis II dalam mengiktiraf dan memotong urutan mudah dalam DNA dalam kedudukan yang tepat menjadikannya salah satu yang paling banyak digunakan dan sangat diperlukan di kebanyakan cabang biologi molekul.

Dalam kumpulan enzim sekatan jenis II adalah pelbagai subclass yang dikelaskan mengikut sifat-sifat tertentu yang unik untuk setiap satu. Pengelasan enzim ini dilakukan dengan menambah huruf abjad, dari A hingga Z yang mengikuti nama enzim.

Sesetengah subkelas yang paling dikenali untuk kegunaannya adalah:

Subclass IIA

Mereka adalah dimer subunit yang berbeza. Mereka mengiktiraf urutan asimetrik dan digunakan sebagai prekursor yang sesuai untuk penjanaan enzim pemotongan.

Subkelas IIB

Mereka terdiri daripada satu lagi dimer dan memotong DNA pada kedua-dua belah urutan pengiktirafan. Mereka memotong kedua-dua helai DNA dalam pelbagai pasangan asas di luar tapak pengiktirafan.

IIC subkelas

Enzim jenis ini adalah polipeptida dengan fungsi pembahagian dan pengubahsuaian helai DNA. Enzim-enzim ini memotong kedua-dua helai asimetri.

Subclass IIE

Enzim subclass ini adalah yang paling banyak digunakan dalam kejuruteraan genetik. Mereka mempunyai tapak pemangkin dan secara umumnya memerlukan pengeluar allosteric. Enzim-enzim ini perlu berinteraksi dengan dua salinan urutan pengiktirafan mereka untuk membuat potongan yang cekap. Dalam subkelas ini adalah enzim EcoRII dan EcoRI.

Enzim sekatan jenis III

Endonucleases jenis III adalah terdiri daripada dua subunit, satu yang bertanggungjawab untuk pengiktirafan DNA dan pengubahsuaian, manakala yang lain bertanggungjawab untuk memotong urutan.

Enzim-enzim ini memerlukan dua cofactors untuk berfungsi: ATP dan magnesium. Enzim sekatan jenis ini mempunyai dua tapak pengiktirafan asimetik, translocate DNA dalam cara yang bergantung kepada ATP dan potong antara 20 hingga 30 bp bersebelahan tapak pengiktirafan..

Jenis enzim sekatan IV

Enzim jenis IV mudah dikenal pasti kerana mereka memotong DNA dengan tag metilasi, mereka terdiri daripada beberapa subunit yang berbeza yang bertanggungjawab untuk mengenal pasti dan memotong urutan DNA. Enzim-enzim ini digunakan sebagai cofactors GTP dan magnesium divalen.

Tapak spesifik untuk pemotongan termasuk rantaian nukleotida dengan sisa-sisa sitosin metilasi atau hidroksimetilasi dalam satu atau kedua helai asid nukleik.

Jenis enzim sekatan V

Klasifikasi ini mengklasifikasikan enzim jenis CRISPER-Cas, yang mengenal pasti dan memotong urutan DNA tertentu daripada organisma yang menyerang. Enzim Cas menggunakan sehelai CRISPER yang disintesis membimbing RNA untuk mengenali dan menyerang organisma yang menyerang.

Enzim dikelaskan sebagai jenis V ialah polipeptida berstruktur dengan enzim jenis I, II dan II. Mereka boleh memotong bahagian DNA dari hampir mana-mana organisma dan dengan pelbagai panjang. Kelenturan dan kemudahan penggunaannya menjadikan enzim ini salah satu alat yang paling biasa digunakan dalam kejuruteraan genetik hari ini bersama dengan enzim jenis II.

Contohnya

Enzim sekatan telah digunakan untuk mengesan polimorfisme DNA, terutamanya dalam kajian genetik penduduk dan kajian evolusi menggunakan DNA mitokondria, untuk mendapatkan maklumat mengenai kadar penggantian nukleotida..

Pada masa ini, vektor yang digunakan untuk transformasi bakteria dengan tujuan yang berbeza mempunyai tapak multiclonache di mana tapak pengiktirafan untuk pelbagai enzim sekatan didapati..

Di antara enzim ini, yang paling popular adalah EcoRI, II, III, IV dan V, yang diperoleh dan diterangkan untuk kali pertama E. coli; HindIII, dari H. influenzae dan BamHI's B. amyloliquefaciens.

Rujukan

  1. Bickle, T. A., & Kruger, D. H. (1993). Biologi Sekatan DNA. Ulasan Mikrobiologi, 57(2), 434-450.
  2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D. A., & Horvath, P. (2007). CRISPR Menyediakan ketahanan terhadap virus dalam prokariota. Sains, 315(Mac), 1709-1713.
  3. Goodsell, D. (2002). Perspektif molekul: Endonucleases Sekatan. Sel Stem Asas Perubatan Kanser, 20, 190-191.
  4. Halford, S. E. (2001). Melompat, melompat dan melengkung oleh enzim sekatan. Transaksi Biokimia Masyarakat, 29, 363-373.
  5. Jeltsch, A. (2003). Penyelenggaraan identiti spesies dan mengawal spesiasi bakteria: fungsi baru untuk sistem pengehadan / pengubahsuaian? Gen, 317, 13-16.
  6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Gen Lewin XII (12 ed.). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
  7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... She, Q. (2015). Memanfaatkan Type I dan Type III CRISPR-Cas sistem untuk penyuntingan genom. Penyelidikan Asid Nukleik, 1-12.
  8. Loenen, W. A.M., Dryden, D.T. F., Raleigh, E.A., & Wilson, G.G. (2013). Jenis I enzim sekatan dan saudara-mara mereka. Penyelidikan Asid Nukleik, 1-25.
  9.  Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Sekatan Endonucleases dalam analisis dan penstrukturan semula molekul DNA. Annu. Wahyu Biokim., 273-293.
  10.  Nei, M., & Tajima, F. (1981). Polimorfisme DNA dikesan oleh endonucleases sekatan. Genetik, 145-163.
  11.  Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Selular dan Molecular Sciences Type II pembatasan endonucleases: struktur dan mekanisme. CMLS Cellular and Molecular Sciences Life, 62, 685-707.
  12.  Roberts, R. (2005). Bagaimana enzim sekatan menjadi kerja biologi molekul. PNAS, 102(17), 5905-5908.
  13.  Roberts, R. J., & Murray, K. (1976). Endonucleases sekatan. Ulasan Kritikal dalam Biokimia, (November), 123-164.
  14.  Stoddard, B. L. (2005). Struktur dan fungsi endonuclease rumah. Ulasan Suku Biofisika, 1-47.
  15.  Tock, M. R., & Dryden, D. T. F. (2005). Biologi sekatan dan anti-sekatan. Pendapat Semasa dalam Mikrobiologi, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
  16.  Wilson, G. G., & Murray, N. E. (1991). Sekatan dan Sistem Pengubahsuaian. Annu. Wahyu Genet., 25, 585-627.
  17.  Wu, Z., & Mou, K. (2016). Wawasan genom ke dalam kemusnahan Campylobacter jejuni dan genetik penduduk. Jangkitan Dis. Translated. Med., 2(3), 109-119.
  18.  Yuan, R. (1981). Struktur dan Mekanisme Endonucleases Sekatan Pelbagai Fungsi. Annu. Wahyu Biokim., 50, 285-315.