Ciri-ciri Proteinase K, aktiviti enzimatik dan aplikasi



The proteinase K adalah enzim yang dimiliki oleh kumpulan protein serine, iaitu, ia mempunyai pusat pemangkin aktifnya sebagai serine asid amino dan mempunyai fungsi memecahkan ikatan peptida oleh hidrolisis. Sebaliknya enzim ini tergolong dalam keluarga protein subtilisin (peptidase S8).

Proteinase K mempunyai berat molekul (MW) sebanyak 28.900 dalton dan terpencil untuk pertama kalinya pada tahun 1974 dari ekstrak cendawan Album Engyodontium, yang sebelum ini dikenali dengan nama Limber album Tritirachium.

Ia membekalkan keupayaan proteolitik yang tinggi, ditunjukkan untuk dapat merendahkan keratin yang ada di rambut. Kata keratin dalam bahasa Inggeris ditulis "keratin", oleh itu ia telah dipanggil "proteinase K".

Kerana kapasiti yang tinggi untuk mengekalkan protein asli, enzim ini berguna dalam pelbagai teknik biologi molekul. Ia digunakan terutamanya untuk mengasingkan dan menyediakan asid nukleik dengan berat molekul yang tinggi (MW).

Proteinase K bertindak dengan melepaskan DNA nuklear, sambil memusnahkan protein dan menyahaktifkan RNases dan DNases, iaitu menghapuskan nukleus dalam persiapan DNA dan RNA..

Sebaliknya, proteinase K dapat menghidrolisis beberapa protein asli denatured, yang telah menimbulkan minat penyelidik untuk kegunaannya dalam kajian protein prion (PrPC).

Walau bagaimanapun, walaupun potensi yang tinggi wujud protein proteolitik yang tahan kepada tindakan proteinase K. Antaranya, beberapa protein yang tidak normal dipanggil prions (PrPSc) yang dikaitkan dengan TSEs adalah.

Indeks

  • 1 Ciri-ciri proteinase K
  • 2 Aktiviti enzimatik
  • 3 Aplikasi
  • 4 Kelebihan proteinase K
  • 5 Protein tahan protein K
  • 6 Rujukan

Ciri-ciri proteinase K

Proteinase K mempunyai struktur tertiari yang dibentuk oleh tiga lapisan, dengan satu lembar β tujuh rantai yang diselaraskan di antara dua helai lapisan. Kerana ia tergolong dalam keluarga peptidase S8, ia dicirikan dengan mempunyai triad pemangkin di tapak aktifnya, yang urutan urutan (Asp, His dan Ser), yang membezakannya daripada keluarga peptidase lain..

Enzim ini dari kumpulan protease serine dicirikan dengan menghidrolisis ikatan peptida dekat dengan kumpulan karboksilat asam amino alifatik dan aromatik.

Selain itu, ia mampu untuk bertindak di hadapan tertentu menghakis, seperti natrium dodecyl sulfat (SDS), Tris-HCL dan EDTA, yang digunakan untuk membantu penyahaslian protein, menyebabkan mereka kehilangan struktur bahan asal mereka.

Ini adalah langkah awal dalam penyediaan protein untuk teknik elektroforesis. Julat pH di mana protease K bertindak agak luas (2.0 hingga 12.0), dengan pH optimum antara 7.5 hingga 12.0, dan titik isoelektriknya ialah 8.9. Seperti yang dapat diperhatikan, ia aktif terhadap pelbagai pH yang sangat luas.

Satu lagi ciri yang menonjol dalam proteinase K adalah kestabilannya dengan kehadiran suhu tinggi (50 - 60 ° C).

Aktiviti enzimatik

Proteinase K memerlukan kehadiran ion kalsium, walaupun ini tidak menjejaskan aktivitinya, jika penting untuk mengekalkan kestabilannya.

Untuk proteinase K untuk menjalankan pencernaan lengkap substrat, satu masa hubungan antara 5 minit dan 2 jam diperlukan.

Walau bagaimanapun, dalam pengertian ini, Daza et al. Membandingkan kemurnian DNA yang diperoleh pada beberapa kali pendedahan kepada proteinase K, dan menyimpulkan bahawa pengeraman yang berkepanjangan (sehingga 24 jam) dengan ketara meningkatkan kualiti DNA.

Sekarang, berhubung dengan kepekatan yang digunakan oleh enzim proteinase K dalam protokol yang berbeza, dapat dikatakan bahawa ia sangat bervariasi.

Ia boleh digunakan dari kepekatan sangat rendah (5 μg / ml) hingga kepekatan 500 μg / ml. Tetapi kepekatan kerja paling kerap berkisar antara 50-100μg / ml, terutamanya untuk pencernaan protein dan penyahaktifan nukilan. Walaupun kepekatan 2 mg / ml diperlukan untuk rawatan tisu.

Permohonan

Aplikasinya sangat luas dan dapat diringkaskan dalam perkara berikut:

-Ia digunakan dalam pencernaan protein dan kaedah pengekstrakan DNA sebagai beberapa: pengasinan keluar, PK-SDS, cetyltrimethylammonium bromida ammonium bromida (CTAB), dan kalium asetat pengekstrakan dengan natrium iodida diubahsuai.

-Inaktivasi nukleases (RNases dan DNases).

-Dalam teknik hibridisasi in situ (HIS), untuk membantu melepaskan asid nukleik, di samping menghapuskan protein yang tidak diingini.

-Pengubahsuaian protein.

-Di peringkat penyelidikan, dalam pelbagai kajian.

Kelebihan proteinase K

Beberapa kajian komparatif telah dilakukan di antara teknik-teknik pengekstrakan DNA menggunakan Proteinase K, dengan yang tidak menggunakannya dan kesimpulan bahawa terdapat manfaat yang lebih besar apabila menggunakan enzim. Antara kebaikan, perkara berikut boleh disebutkan:

-DNA berat molekul tinggi berkualiti tinggi dan kesucian diperolehi.

-DNA yang diekstrak stabil sehingga 3 bulan.

DNA yang diekstrak boleh digunakan dalam teknik berikut: Blot Selatan, reaksi rantai polimerase (PCR), elektroforesis, antara lain.

Protein tahan proteinase K

Kajian telah membuat kesimpulan bahawa prions (PrPSc toksik protein abnormal) adalah berbeza daripada protein PRPC (asli) untuk menjadi tahan kepada tindakan proteinase K, manakala PRPC sensitif kepada tindakan.

Penulis lain telah menyatakan bahawa dalam struktur Prpc terdapat bahagian yang sensitif dan yang lain menentang proteinase K. Walau bagaimanapun, kedua-dua bahagian tersebut sama-sama toksik dan infektif..

Sebaliknya, Bastian dan kolaborator pada tahun 1987 mengisolasi 4 protein 28, 30, 66 dan 76 kda dari spesies Spiroplasma mirum. Semua itu tahan terhadap tindakan proteinase K dan juga mempunyai tindak silang silang dengan beberapa prion.

Adalah diketahui bahawa spesies ini boleh menyebabkan katarak dan kerosakan neurologi yang ketara dan kerana penemuan saintifik Bastian, antara penyelidikan yang lain, telah cuba untuk pautan ke mikroorganisma ini dengan encephalopathies spongiform berjangkit.

Walau bagaimanapun, etiologi patologi neurologi degeneratif ini masih dikaitkan dengan prion hari ini.

Dalam pengertian ini, Butler dan kolaborator pada tahun 1991 mengenal pasti dan mencirikan kelas protein K protein protein K 40 dari dua strain Mycoplasma hyorhinis. Patogen ini memberi kesan kepada babi, menjangkiti tisu mereka, tetapi dalam kes ini tidak ada reaksi salib dengan prion yang diuji.

Lebih banyak penyelidikan diperlukan untuk menjelaskan banyak yang tidak diketahui mengenainya.

Rujukan

  1. Bastian F, Jennings R, dan Gardner W. 1987. Antiserum untuk mengawal protein fibril yang berkaitan dengan scrapie Spiroplasma mirum protein fibril. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
  2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. Evaluasi kaedah pengekstrakan dan pemurnian DNA dari tisu otot yang tetap dalam formaldehid dari bangkai tak dikenal.  Maj Magazine, 2014; 22 (1): 42-49,
  3. Butler G, Kotani H, Kong L, M Frick, Evancho S, Stanbridge E, Dan McGarrity G. Pengenalan dan Pencirian Proteinase Protein K-Tahan dalam Ahli-ahli Kelas Mollicutes. Jangkitan dan Kekebalan, 1991, 59 (3): 1037-1042
  4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Perbandingan dua protokol untuk mengeluarkan DNA dari Trypanosoma cruzi ditanam dalam medium axenic. Wah, Peru. Med Exp. Kesihatan Awam  2014; 31 (2): 222-227. Boleh didapati di: scielo.org
  5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E dan Palma W. Penentuan keberkesanan lima protokol pengekstrakan DNA dari bahan parafin untuk kajian molekul. Rev Méd Univ Costa Rica. 2007; 1 (1): 10-19.