Susunan DNA Maxam-Gilbert, kaedah Sanger, contoh



The Penjujukan DNA (asid deoksiribonukleat) adalah prosedur yang dilakukan dalam makmal biologi molekul yang membolehkan mengetahui urutan nukleotida dalam bahan genetik yang menarik. Di samping itu, urutan RNA (asid ribonukleat) juga boleh didedahkan.

Teknik ini amat diperlukan untuk perkembangan sains biologi. Ia juga boleh digunakan untuk bidang pengetahuan lain - seperti diagnosis perubatan dan penyiasatan forensik, sebagai contoh.

Sebelum ini, urutan sekumpulan DNA dianggap sebagai aktiviti perlahan dan mahal, yang membolehkan pengenalpastian hanya beberapa pasangan asas dalam oligonukleotides.

Hari ini, dengan semua kemajuan sains, penjujukan DNA adalah operasi rutin di banyak makmal terima kasih di seluruh dunia kepada sumbangan hampir 50 tahun penyelidikan dalam bidang ini. Sebagai panjang rantai, ia boleh disusun kepada berjuta-juta pasangan bes dalam masa yang singkat.

Untuk berbuat demikian, terdapat puluhan teknik yang dibangunkan yang berbeza dengan harga dan ketepatan. Dalam artikel ini, kami akan menerangkan kedua-dua teknik klasik dan moden, masing-masing dengan kelebihan dan kekurangannya.

Setakat ini, teknik penjujukan membolehkan untuk mendapatkan urutan genom lengkap, dari prokariot kecil dan ragi kepada genom manusia.

Indeks

  • 1 Struktur DNA
  • 2 Sejarah
  • 3 kaedah Sanger
    • 3.1 Komponen utama tindak balas
    • 3.2 Membaca keputusan
  • 4 Penjujukan automatik
  • 5 penjujukan Maxam-Gilbert
    • 5.1 Prosedur
    • 5.2 Membaca keputusan
  • 6 Penjujukan besar-besaran
    • 6.1 Pyrosequencing
    • 6.2 Urutan dengan sintesis
    • 6.3 Mengikut ligation
    • 6.4 Sequencing Ion Torrent
  • 7 Contoh
    • 7.1 Penjujukan genom manusia
  • 8 Kepentingan dan aplikasi
  • 9 Rujukan

Struktur DNA

Untuk memahami kaedah dan teknik yang digunakan untuk penjujukan DNA, adalah penting untuk mengetahui aspek utama struktur dan komposisi molekul.

DNA adalah biomolekul yang terdapat dalam semua makhluk hidup, dari bakteria hingga haiwan akuatik yang besar. Organel - seperti mitokondria dan kloroplas - mempunyai molekul DNA bulat di dalamnya. Malah dalam beberapa virus, bahan genetik yang ditemui adalah DNA.

Secara struktural, DNA adalah satu set nukleotida. Setiap satu diintegrasikan oleh karbohidrat, asas nitrogenus (A, T, C atau G) dan kumpulan fosfat. Matlamat penjujukan DNA adalah untuk mendedahkan urutan di mana empat pangkalan nitrogenous dijumpai dalam urutan.

Sejarah

Pada pertengahan tahun 1950-an, penyelidik Watson dan Crick menggambarkan struktur DNA menggunakan teknik-teknik Kristologi. Walau bagaimanapun, tiada seorang pun penyelidik telah dapat mencari jalan untuk mendedahkan urutan tersebut.

Walaupun ada beberapa terdahulu, acara yang paling penting ialah mewujudkan kaedah Sanger, dalam tahun 1977. Frederick Sanger, bapa kaedah adalah seorang ahli biokimia British, pemenang dua hadiah Nobel atas sumbangan besar mereka kepada sains biologi.

Teknik ini juga diketahui dalam kesusasteraan sebagai "penghentian rantai" atau dideoxynucleotides. Selanjutnya kita akan menerangkan prinsip-prinsip teknik ini dan yang dibangunkan berdasarkan peningkatan dan inovasi ini.

Kaedah Sanger

Perkembangan kaedah Sanger mewakili peristiwa penting dalam biologi molekular. Ia melibatkan komponen asas proses replikasi DNA yang biasanya berlaku dalam sel, tetapi dengan menambah komponen khas: dideoxynucleotides.

Komponen utama tindak balas

- DNA polymerase: polymerase DNA enzim adalah unsur-unsur proses kritikal. Molekul ini terlibat dalam replikasi DNA helai dan peranannya adalah sintesis rantai baru, yang hampir sama dengan triphosphates deoxyribonucleotide pelengkap.

Ingat bahawa thymine DNA (T) mengawan dengan adenines (A) melalui dua ikatan hidrogen, manakala sitosin (C) membuat dengan guanine (G) dengan tiga jambatan.

- Nukleotida Sanger penjujukan melibatkan dua jenis nukleotida, 2'-deoxynucleotides empat (disingkatkan sebagai dATP, dGTP, dTTP dan dCTP) dan empat dideoxynucleotides (ddATP, ddGTP, ddCTP dan ddTTP) Khas.

Walaupun dideoxynucleotides sama dengan monomer yang biasanya dimasukkan ke dalam DNA, mereka tidak mempunyai kumpulan -OH dalam struktur mereka. Ini menjadikannya mustahil untuk menambah nukleotida baru pada rantai.

Oleh itu, apabila nukleotida khas ditambah - secara rawak - untuk rantaian dalam pembentukan, sintesis lumpuh. Dengan cara ini, pada akhir tindak balas, terdapat rantai saiz yang berlainan, masing-masing di mana reaksi dihentikan pada titik yang berbeza.

Eksperimen, empat ujian disediakan. Setiap mengandungi DNA yang diekstrak daripada sampel faedah biologi, nukleotida biasa dan satu daripada empat jenis nukleotida khas. Atau nukleotida khas ditandai dengan beberapa jenis penanda pendarfluor (lihat di bawah penjujukan automatik).

Membaca keputusan

Langkah pertama ialah untuk memisahkan setiap rantai yang disintesis mengikut saiznya. Sesetengahnya akan lebih lama daripada yang lain, bergantung di mana asas khusus dimasukkan.

Terdapat teknik biokimia yang berbeza yang membolehkan pemisahan komponen campuran menggunakan saiz sebagai harta yang diskriminasi. Dalam kaedah Sanger, rantai yang berbeza dipisahkan oleh elektroforesis. Dalam varian paling canggih teknik ini, elektroforesis kapilari digunakan.

Oleh itu, helai yang lebih panjang bergerak kurang daripada variasi yang lebih pendek. Kemudian, sistem ini melalui pembaca yang mengiktiraf penanda termasuk dalam setiap dideoxynucleotide. Dengan cara ini, urutan urutan boleh diketahui.

Teknik "generasi pertama" ini dapat membaca serpihan DNA tidak lebih dari 1 kilobase. Pada masa ini, kaedah Sanger digunakan di beberapa makmal, umumnya dalam varian modennya. Di samping itu, ia digunakan untuk menyokong keputusan yang diperolehi dengan teknik yang paling kompleks - tetapi kurang tepat.

Penjujukan automatik

Apabila penjujukan berskala besar diperlukan, proses dipercepatkan oleh automasi. Ini adalah variasi kaedah penamatan rantaian Sanger, di mana primer ditandai dengan produk pendarfluor untuk membezakannya.

Selanjutnya, produk tindak balas dijalankan dalam elektroforesis - semua dalam lorong tunggal. Apabila setiap pecahan meninggalkan bahagian terakhir gel, ia dengan cepat dikenal pasti dengan label neonnya, dengan ralat yang mengelilingi 1%.

Sistem yang paling canggih mempunyai sistem sehingga 96 tiub kapilari yang dikendalikan oleh komputer yang digabungkan dengan robot. Iaitu, 96 sampel DNA boleh dinilai secara serentak. Oleh itu, proses yang melibatkan elektroforesis dan analisis keputusan sepenuhnya automatik.

Dalam satu hari, sistem ini boleh menyusun sehingga 550,000 pangkalan. Semasa proses itu, kerja manusia tidak diperlukan, hanya mengambil masa kira-kira 15 minit untuk memulakan kaedah.

Urutan oleh Maxam-Gilbert

Pada masa yang sama Sanger menerbitkan karya beliau, dua penyelidik bernama Allan Maxan dan Walter Gilbert berjaya mengembangkan satu lagi kaedah untuk mendapatkan urutan DNA. Kaedah itu mendapat populariti pada masa itu, tetapi kemudiannya dipindahkan oleh peningkatan kaedah Sanger.

Bertentangan dengan kaedah Sanger, penjujukan Maxan dan Gilbert (atau penjujukan kimia, sebagaimana diketahui juga) tidak melibatkan tindak balas hibridisasi. Metodologi ini terdiri daripada tanda dengan ejen reaktif pada satu hujung, diikuti dengan proses pembersihan.

Salah satu aspek negatif teknik ini terletak pada kerumitan yang sangat besar dan penggunaan bahan kimia yang berbahaya bagi pengguna. Kerosakan kimia didorong oleh penggunaan DMS, asid formik, hidrazin dan hidrazin dengan garam.

Prosedur

Protokol ini bermula dengan pelabelan pada akhir 5 '' untai dengan penanda fosfor 32, maka pengubahsuaian kimia asas nitrogenus berlaku dan ia dipisahkan. Akhirnya pembahagian rantau abasik berlaku.

Mula-mula rantai yang akan disusun dipendekkan menjadi segmen yang lebih kecil. Langkah ini dilakukan dengan enzim sekatan, yang menghasilkan ekstrem yang luar biasa.

Seterusnya, tindak balas dijalankan dengan fosfatase alkali, yang bertujuan untuk menghapuskan kumpulan fosfat. Oleh itu, kinase polynucleotide dapat digunakan untuk melakukan pelabelan.

Rantaian itu denatured (kedua helai terbuka). Kemudian kami teruskan memohon bahan kimia tersebut. Reaksi belahan ini dilakukan secara terkawal dan jenis bon yang dipecahkan oleh setiap bahan kimia yang digunakan.

Membaca keputusan

Seperti dalam kaedah Sanger, pembacaan keputusan melibatkan pemisahan dengan saiz rantai yang diperolehi dalam sistem elektroforesis. Sistem yang terdiri daripada polyacrylamide membolehkan untuk mendapatkan resolusi yang sangat mencukupi untuk membaca gel.

Penjujukan besar-besaran

Penjujukan besar-besaran merangkumi satu siri kaedah novel, disingkatkan sebagai NGS, dari bahasa Inggeris "Penggubahan Generasi Seterusnya ".

Kaedah yang dikelaskan sebagai NGS memerlukan langkah penguatan DNA terdahulu (mereka tidak berfungsi dengan molekul tunggal). Di samping itu, platform yang digunakan berbeza-beza. Prinsip kaedah yang paling popular akan diterangkan di bawah:

Pyrosequencing

Ia melibatkan pemantauan pelepasan pirofosfat, yang berlaku setiap kali nukleotida baru ditambahkan ke helai DNA. Sistem enzim digabungkan, supaya pelepasan cahaya (yang dapat dikesan oleh kamera) berlaku setiap kali nukleotida baru diperbadankan.

Proses ini bermula dengan inkubasi berasingan setiap asas nitrogenous untuk mengesahkan sama ada terdapat pelepasan cahaya atau tidak. Pyrosequencing boleh melakukan bacaan lembaran panjang, tetapi kadar ralat didapati tinggi.

Urutan dengan sintesis

Ini melibatkan penggabungan nukleotida berlabel. Komponen pendarfluor ini ditambah, dibasuh, dan nukleotida yang dimasukkan. Kemudian, pelabelan nukleotida dihapuskan, dan sintesis strand dapat diteruskan. Dalam langkah seterusnya, nukleotida berlabel juga akan dimasukkan, dan langkah-langkah yang disebutkan akan diulang.

Satu kelemahan dengan teknik ini berlaku apabila penanda pendarfluor tidak sepenuhnya dihapuskan. Pelepasan ini membuat ralat latar belakang, mengakibatkan kesilapan besar.

Mengikut ligation

Teknik ini berbeza dari yang lain, kerana ia tidak menggunakan polimerase DNA. Sebaliknya, enzim utama untuk metodologi ini adalah ligase. Di sini digunakan serpihan DNA yang digunakan secara fluoresen, diikat oleh enzim dan dikesan.

Masalah terbesar dengan teknik ini adalah panjangnya serpihan yang mampu diproses.

Ion Sequencing Torrent

Teknik ini adalah berdasarkan pengukuran H ion+ yang dikeluarkan setiap kali nukleotida baru diperbadankan. Prinsipnya hampir sama dengan pyrosequencing, tetapi lebih murah.

Contohnya

Penjujukan genom manusia

Mengikut genom manusia telah menjadi salah satu cabaran yang paling menjanjikan dalam biologi, serta menjadi salah satu persaingan yang paling terkenal dalam sejarah sains. Malah, bagi para saintis yang terlibat dalam projek itu, penjujukan genom menjadi persaingan.

Pada tahun 1990 ia memulakan apa yang dikenali sebagai "projek genom manusia", yang diketuai oleh saintis terkenal, pemenang Hadiah Nobel, James Watson. Selepas satu tahun, pada tahun 1991, Venter mengambil cabaran untuk "mengalahkan" Watson dan menjejaki genominya. Walau bagaimanapun, pada tahun 1992, Watson bersara dan perintah itu diambil oleh seorang penyelidik lain.

Pada tahun 1995 Venter mengumumkan kejayaannya dalam penjujukan lengkap genom bakteria melalui kaedah penjujukan rawak. Begitu juga, pasukan bertentangan mengumumkan satu tahun kemudian penjujukan genom yis.

Pada tahun 2000 perlumbaan telah ditamatkan. Kedua-dua syarikat menerbitkan hasil awal genom lengkap dalam dua jurnal yang paling berprestij dalam sains: Alam dan Sains.

Bagaimanapun, saintis terus berusaha untuk memperbaiki cadangan itu, dan pada tahun 2006 urutannya telah selesai kromosom manusia tertentu.

Kepentingan dan aplikasi

Mengetahui susunan nukleotida molekul yang sama pentingnya dengan DNA sangat berharga untuk ahli biologi dan profesional yang berkaitan. Rangkaian polynucleotides ini mengandungi semua maklumat yang diperlukan untuk pembangunan dan penyelenggaraan semua bentuk kehidupan.

Atas sebab-sebab ini, pengetahuan tentang urutan ini penting untuk penyelidikan biologi. Secara asasnya, penjujukan membolehkan kita mengukur salah satu sifat yang paling penting dalam sistem biologi dan untuk menentukan perbezaan di antara mereka.

Sequencing digunakan secara meluas oleh ahli taksonomi dan sistematik, kerana urutan DNA tertentu membolehkan kriteria untuk membuat kesimpulan sama ada dua organisma tergolong dalam spesies yang sama atau tidak, dan juga dapat mencadangkan hipotesis tentang hubungan filogenetik di antara mereka..

Di samping itu, penjujukan DNA mempunyai aplikasi dalam bidang perubatan dan diagnostik. Sebagai contoh, terdapat sistem yang berpatutan dan boleh diakses yang, melalui urutan, membolehkan kita menilai kecenderungan untuk membangunkan penyakit-penyakit tertentu (seperti kanser) menggunakan apa yang dipanggil polimorfisme nukleotida mudah (SNP)..

Penyiasatan jenis kejahatan dan forensik juga telah diperkaya dengan teknik penjujukan, dan boleh digunakan sebagai bukti yang dapat dipercayai tentang penyertaan individu tertentu dalam jenayah.

Rujukan

  1. Heather, J. M., & Chain, B. (2016). Urutan sequencers: sejarah penjujukan DNA. Genomik, 107(1), 1-8.
  2. Koboldt, D.C., Steinberg, K.M., Larson, D.E., Wilson, R.K., & Mardis, E.R. (2013). Generasi seterusnya penjajahan revolusi dan impaknya terhadap genomik. Sel, 155(1), 27-38.
  3. Levy, J. (2010). Persaingan saintifik. Dari Galileo ke projek genom manusia. Editorial Paraninfo.
  4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A. R. (1977). Penjujukan DNA dengan perencat pengakhiran rantai. Prosiding akademi kebangsaan akademik, 74(12), 5463-5467.
  5. Schuster, S. C. (2007). Penjujukan generasi seterusnya mengubah biologi hari ini. Kaedah alam semula jadi, 5(1), 16.
  6. Xu, J. (Ed.). (2014). Penggubahan generasi seterusnya. Akademik Akhbar Caister.