Asas pewarnaan, bahan, teknik dan kegunaan Giemsa



The Giemsa noda adalah sejenis pewarnaan sampel klinikal, berdasarkan campuran asid dan pewarna asas. Penciptaannya telah diilhami oleh karya yang dilakukan oleh Romanowsky, di mana Gustav Giemsa, ahli kimia dan bakteriologi asalnya dari Jerman, menyempurnakannya dengan menambah gliserol untuk menstabilkan sebatian.

Perubahan yang dihasilkan kepada teknik asal Romanowsky diperbolehkan untuk memperbaiki pengamatan mikroskopik, oleh itu teknik dibaptiskan dengan nama Giemsa noda.

Kerana ia adalah teknik yang mudah untuk dilaksanakan, sangat berfungsi dan ekonomis, ia kini digunakan secara meluas dalam makmal klinikal untuk smear hematologi, sampel sumsum tulang dan bahagian-bahagian tisu..

Teknik pewarnaan Giemsa sangat berguna untuk kajian sitologi, kerana ia membolehkan pemerhatian terhadap struktur sel tertentu. Teknik ini mengotorkan sitoplasma, nukleus, nukleoli, vakuola dan granul sel, dapat membezakan kesan-kesan halus chromatin.

Di samping itu, perubahan ketara dalam saiz, bentuk atau warna nukleus dapat dikesan, di mana mungkin untuk menggambarkan kehilangan hubungan nukleus-sitoplasma.

Sebaliknya, ia membolehkan untuk mengenal pasti sel belum matang dalam sumsum tulang dan darah periferal, yang penting untuk diagnosis penyakit-penyakit serius seperti leukemia. Ia juga mungkin untuk mengesan hemoparasit, bakteria tambahan dan intraselular, kulat, antara lain.

Dalam cytogenetics ia agak digunakan, kerana ia adalah mungkin untuk mengkaji mitosis sel.

Indeks

  • 1 Asas warna Giemsa
  • 2 Bahan
    • 2.1 Bahan untuk penyediaan penyelesaian ibu
    • 2.2 Penyediaan penyelesaian ibu
    • 2.3 Bahan untuk menyediakan penyelesaian penampan
    • 2.4 Penyediaan akhir pewarna
    • 2.5 Bahan tambahan yang diperlukan untuk melakukan pewarnaan
  • 3 Teknik
    • 3.1 Proses penahan
  • 4 Utiliti
    • 4.1 Hematologi
    • 4.2 Mycology
    • 4.3 Bakteria
    • 4.4 Parasitologi
    • 4.5 Cytology
    • 4.6 Cytogenetics
  • 5 Penyelidikan menunjukkan keberkesanan pemadaman Giemsa
  • 6 Cadangan untuk pewarnaan yang baik
  • 7 Kesilapan biasa dalam pewarnaan Giemsa
    • 7.1 Warna pewarna biru
    • 7.2 Pewarna merah jambu yang berlebihan
    • 7.3 Kehadiran precipitates dalam smear
    • 7.4 Kehadiran artifak morfologi
  • 8 mod Penyimpanan
  • 9 Rujukan

Asasi warna Giemsa

Pewarna jenis Romanowsky adalah berdasarkan penggunaan kontras antara asid dan pewarna asas, untuk mencapai pewarnaan struktur asas dan asid, masing-masing. Seperti yang dapat dilihat terdapat pertalian dari pewarna asid untuk mewarna struktur asas dan sebaliknya.

Pewarna asas yang digunakan adalah metilena biru dan turunannya yang teroksidasi (Azure A dan Azure B), manakala pewarna asid adalah eosin.

Struktur asam sel adalah asid nukleat, granul dari basofil yang tersegmentasi, antara lain, maka mereka akan dicelup dengan metilena biru.

Dalam erti kata yang sama, struktur asas sel-sel adalah hemoglobin dan beberapa granul seperti yang terkandung di dalam eosinofils yang tersegra, antara lain; ini akan dicelup dengan eosin.

Sebaliknya, disebabkan oleh metilena biru dan azur yang dicirikan oleh pewarna metachromatic, mereka dapat memberikan nada berubah kepada struktur yang berbeza mengikut beban polyanion yang mereka miliki..

Inilah bagaimana gabungan strategik pewarna asas dan asid dapat mengembangkan spektrum warna yang luas, mengikut ciri-ciri biokimia setiap struktur, berjalan melalui warna biru pucat, biru gelap, ungu dan ungu dalam hal struktur berasid.

Walaupun warna yang disediakan oleh eosin lebih stabil, menghasilkan warna antara merah-oren dan salmon.

Bahan

Bahan untuk penyediaan penyelesaian ibu

Penyediaan larutan stok memerlukan seberat 600 mg serbuk Giemsa, mengukur 500 cc metil alkohol tanpa aseton dan 50 cc gliserin neutral.

Cara penyediaan penyelesaian ibu

Letakkan serbuk Giemsa berat dalam mortar. Sekiranya ada ketulan, mereka perlu disembur. Selepas itu, tambah sejumlah besar gliserin yang diukur dan gaul dengan baik. Campuran yang diperolehi dicurahkan ke dalam botol ambar yang sangat bersih.

Selebihnya gliserin diletakkan di dalam mortar. Campurkan sekali lagi untuk membersihkan pewarna yang tersisa yang telah terikat pada dinding mortar dan tuangkan ke dalam botol yang sama.

Botol dilindungi dan dibawa selama 2 jam di mandi air pada 55ºC. Semasa dalam mandi bain-marie, perlahan-lahan kacau campuran setiap setengah jam atau lebih.

Selepas itu, campuran dibiarkan sejuk untuk meletakkan alkohol. Sebelum ini, sebahagian daripada alkohol yang diukur diletakkan di dalam mortar untuk menyelesaikan basuh apa yang tersimpan dalam pewarna dan kemudian ia ditambah kepada campuran bersama-sama dengan alkohol yang lain.

Penyediaan ini hendaklah dibenarkan untuk matang sekurang-kurangnya 2 minggu. Bahagian yang digunakan dalam larutan ibu mesti ditapis.

Untuk mengelakkan pencemaran penyediaan, disyorkan untuk lulus bahagian yang akan terus digunakan untuk botol ambar kecil dengan penitis. Caj semula setiap kali reagen habis.

Bahan untuk menyediakan penyelesaian Buffer

Sebaliknya, penyelesaian penampan pada pH 7.2 disediakan seperti berikut:

6.77 gram natrium fosfat (anhydrous) ditimbang (NaHPO4), 2.59 g kalium dihydrogen fosfat (KH)2PO4) dan air suling sehingga 1000 cc.

Penyediaan akhir pewarna

Untuk penyediaan penyelesaian pewarnaan akhir, 2 cc larutan stok ditapis diukur dan dicampur dengan 6 cc larutan penampan. Campuran diaduk.

Fakta yang berkaitan yang harus diambil kira, adalah teknik penyediaan pewarna itu boleh berubah mengikut rumah komersial.

Bahan tambahan yang diperlukan untuk melakukan pewarnaan

Selain daripada bahan-bahan yang diperihalkan, ia mesti disediakan dengan jambatan warna, skrin air atau penampan untuk mencuci, cadar untuk objek atau penutup, jam randik untuk mengawal masa pewarnaan dan kertas blotting atau bahan yang boleh digunakan untuk mengeringkan ( kasa atau kapas).

Teknik

Proses penahan

1) Sebelum pewarna, anda mesti mempunyai penyebaran sampel pada slaid bersih..

Sampel boleh menjadi darah, sumsum tulang, pemotongan tisu histologi atau sampel cervico-vagina. Adalah disyorkan bahawa bahagian luar menjadi nipis dan mempunyai 1 atau 2 jam pengeringan sebelum mewarna mereka.

2) Semua helaian yang anda perlu warna diletakkan pada jambatan berwarna. Sentiasa bekerja dalam susunan yang sama dan kenalpasti setiap lembaran dengan baik.

3) Letakkan beberapa tetes 100% metil alkohol (metanol) pada smear dan biarkan selama 3 hingga 5 minit, untuk membetulkan dan menyahihkan sampel.

4) Buang methanol yang ada di dalam lembaran dan biarkan udara kering.

5) Setelah kering, letakkan penyelesaian pewarnaan akhir dengan penitis sehingga seluruh helai dilindungi. Biarkan selama 15 minit. Sesetengah penulis mengesyorkan sehingga 25 minit. Bergantung pada rumah komersial.

6) Tuangkan pewarna itu dan basuhlah cairan dengan air suling atau dengan 7.2 larutan penampan.

7) Pada kertas yang membungkus biarkan lembaran kering di udara terbuka, diatur secara menegak dengan bantuan sokongan.

8) Lapkan bahagian belakang slaid dengan kain kasa atau kain kapas yang dibasahkan dengan alkohol untuk menghapus sebarang pewarna yang tinggal.

Utiliti

Teknik pewarnaan Giemsa digunakan dalam beberapa bidang, termasuk: hematologi, mikologi, bakteriologi, parasitologi, sitologi dan sitogenetik.

Hematologi

Ia adalah utiliti yang paling kerap diberikan kepada pewarnaan ini. Dengan itu, kita boleh mengenal pasti setiap sel yang hadir dalam sampel tulang sumsum atau darah periferal. Serta menganggarkan bilangan setiap siri, dapat mengesan leukositosis atau leukopenia, thrombocytopenia, dan lain-lain..

Kerana ia sensitif untuk mengenal pasti sel-sel yang tidak matang, adalah relevan dalam diagnosis leukemia akut atau kronik. Ia juga mungkin untuk mendiagnosis anemia, seperti penyakit sel sabit, penyakit sel sabit, dan lain-lain..

Mycology

Di kawasan ini adalah perkara biasa untuk menggunakannya untuk mencari Histoplasma capsulatum (kulat dimorphik intrasel) dalam sampel tisu.

Bakteria

Dalam smem haematologi ternoda dengan Giemsa adalah mungkin untuk mengesan Borrelias sp pada pesakit yang mempunyai penyakit yang dikenali sebagai recurrentis demam. Spirochetes banyak di kalangan eritrosit, dalam sampel yang diambil pada puncak demam.

Ia juga mungkin untuk menggambarkan bakteria intraselular sebagai Rickettsias sp dan Chlamydia trachomatis dalam sel yang dijangkiti.

Parasitologi

Dalam bidang parasitologi, pewarnaan Giemsa telah membenarkan diagnosis penyakit parasit seperti malaria, penyakit Chagas dan leishmaniasis..

Dalam dua parasit pertama Plasmodium sp dan Trypanosoma cruzi masing-masing boleh divisualisasikan dalam darah periferi pesakit yang dijangkiti, mereka boleh didapati di peringkat yang berlainan mengikut fasa di mana penyakit itu.

Untuk meningkatkan pencarian parasit darah, disarankan untuk menggunakan noda Giemsa dicampur dengan dye May-Grünwald.

Begitu juga, leishmaniasis kutaneus boleh didiagnosis apabila menilai sampel biopsi kulit yang berwarna dengan Giemsa, di mana parasit tersebut dijumpai.

Cytology

Pewarnaan Giemsa juga digunakan untuk kajian sitologi sintesis endoservis, walaupun bukan teknik yang paling sering digunakan untuk tujuan ini.

Tetapi dalam kes kekurangan sumber boleh digunakan, mempunyai fungsi yang serupa dengan yang ditawarkan oleh teknik Papanicolaou dan pada kos yang lebih rendah. Walau bagaimanapun, ia memerlukan kepakaran di pihak pemeriksa.

Cytogenetics

Ciri yang berkaitan dengan pewarnaan Giemsa adalah keupayaannya untuk mengikat dengan kuat ke kawasan-kawasan kaya dengan adenin dan tymena DNA. Ini membolehkan DNA divisualisasikan semasa mitosis sel-sel, dalam keadaan pemeluwapan yang berlainan.

Kajian-kajian ini adalah perlu untuk mengesan penyimpangan kromatik seperti duplikasi, penghapusan atau translocations dari pelbagai daerah kromosom..

Penyelidikan menunjukkan keberkesanan pemadaman Giemsa

Cannova et al (2016), berbanding 3 teknik pewarnaan untuk diagnosis leishmaniasis kulit.

Untuk ini, mereka menggunakan sampel yang didapati dari haiwan eksperimen (Mesocrisetus auratus) secara eksperimen disuntik dengan Leishmanias.

Penulis menunjukkan bahawa pewarnaan Giemsa lebih baik daripada pewarnaan Pap-mart® dan Gaffney. Oleh itu, mereka menganggap bahawa noda Giemsa adalah ideal untuk mendiagnosis leishmaniasis kutaneus.

Keputusan cemerlang yang diperolehi oleh penulis adalah disebabkan oleh gabungan pewarna yang membentuk campuran Giemsa membentangkan syarat-syarat yang perlu untuk mewujudkan satu perbezaan yang menggalakkan, membolehkan struktur perbezaan yang jelas amastigotes intra dan extracellularly.

Teknik lain (Pap-mart® dan Gaffney) juga melakukannya, tetapi dengan cara yang lebih lemah dan oleh itu lebih sukar untuk digambarkan. Itulah sebabnya noda Giemsa disyorkan untuk diagnosis parasitologi leishmaniasis.

Begitu juga, kajian oleh Ramirez et al (1994) menilai kesahihan Giemsa dan Lendrum dalam calitan konjunktiva untuk mengenal pasti Chlamydia trachomatis.

Penulis menentukan bahawa pewarnaan Giemsa dan Ledrum mempunyai kekhususan yang sama, tetapi Giemsa lebih sensitif.

Ini menjelaskan kenapa kini pewarnaan Giemsa adalah yang paling kerap digunakan untuk diagnosis jangkitan klamid, terutama jika terdapat sedikit sumber.

Cadangan untuk pewarnaan yang baik

Pengeringan lembaran tidak boleh dipercepatkan. Masa berhemat harus menunggu untuk mengeringkannya di udara terbuka. Kira-kira 2 jam.

Warna segera selepas 2 jam untuk hasil terbaik.

Untuk smear yang akan diperbetulkan dan diwarnai dengan lebih baik, sampel mesti diedarkan pada lembaran sedemikian rupa sehingga lapisan nipis dan seragam tetap.

Sampel darah pilihan adalah kapilari, karena smear dibuat secara langsung dari setetes darah dan oleh karena itu sampel tidak mempunyai aditif, yang menguntungkan penyelenggaraan struktur sel.

Walau bagaimanapun, jika darah vena digunakan, EDTA harus digunakan sebagai antikoagulan dan bukan heparin, kerana sel-selnya biasanya merubah sel-sel.

Kesilapan biasa dalam pewarnaan Giemsa

Dalam amalan pewarnaan ini, kesilapan boleh dibuat. Mereka dibuktikan dengan perubahan mendadak dalam warna struktur.

Pewarna biru yang sangat

Ia boleh disebabkan oleh:

  • Smear sangat tebal
  • Melebihi masa pewarnaan
  • Terlalu sedikit basuh.
  • Penggunaan reagen di atas pH neutral (alkali).

Dalam keadaan ini warna struktur berikut diputarbelitkan, supaya eritrosit bukannya dicelup merah jambu salmon akan menjadi hijau, granul eosinofil yang perlu berwarna bata merah kebiruan atau kelabu akan bertukar dan sebagainya kehendak sisihan dalam kesamaan biasa.

Warna merah jambu yang berlebihan

Ia mungkin disebabkan oleh:

  • Masa pewarnaan yang tidak mencukupi.
  • Basuh yang berpanjangan atau berlebihan.
  • Pengeringan yang buruk.
  • Penggunaan reagen berasid sangat.

Dalam kes ini, struktur yang biasanya berwarna biru tidak akan kelihatan hampir, manakala struktur yang berwarna merah jambu akan mempunyai tonalities yang sangat dibesar-besarkan.

Contoh: eritrosit mengambil warna merah atau oren terang yang kuat, chromatin nuklear akan pucat merah jambu dan granul eosinofil cemar merah sengit.

Kehadiran precipitates dalam smear

Penyebabnya boleh:

  • Gunakan lembaran kotor atau tidak dibasuh.
  • Jangan biarkan tirus kering dengan baik.
  • Biarkan penyelesaian penetapan terlalu lama.
  • Cucian tidak mencukupi pada akhir pewarnaan.
  • Penapisan yang tidak mencukupi atau penapisan pewarna yang tidak digunakan.

Kehadiran artifak morfologi

Artefak morfologi mungkin muncul di dalam smear, sehingga sukar untuk memvisualisasikan dan mentafsirkan struktur yang ada. Ini adalah kerana:

  • Jenis antikoagulan yang digunakan, seperti heparin.
  • Penggunaan lembaran kotor, rosak atau berminyak.

Mod storan

Selepas penyediaan, pewarna perlu disimpan pada suhu bilik (15 - 25 ° C), untuk mengelakkan pewarna dari mencetuskan. Ia mesti disimpan dalam bekas ambar tertutup.

Rujukan

  1. Cannova D, Brito E dan Simons M. Penilaian teknik pewarnaan untuk diagnosis Leishmaniasis kulit. Salus.  2016; 20 (2): 24-29.
  2. PanReac Applichem ITW Reagen. Giemsa noda. Versi 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Sepanyol.
  3. Clark G. Tatacara penangkapan (1981), 4thed. Williams & Willkins.
  4. Kimia Klinikal Gunaan Pewarna Giemsa untuk diagnosis dalam vitro. Pengedar: cromakit.es
  5. Ramirez R, Mejia M, Garcia de la Riva J, F dan Hermes Grazioso C. Kesahan Giemsa dan Lendrum dalam swab konjunktiva untuk mengenal pasti Chlamydia trachomatis. Bol dari Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212-216.
  6. Casas-Rincon G. Umumnya Mycology. 1994. 2nd Ed. Universidad Central de Venezuela, edisi Perpustakaan. Venezuela, Caracas.
  7. "Giemsa noda." Wikipedia, ensiklopedia percuma. 1 Sep 2017, 01:02 UTC. 6 Dis 2018, en.wikipedia.org.