Yayasan Ziehl-Neelsen, Reagen dan Teknik



The Ziehl-Neelsen noda dalam teknik pewarna untuk mengenalpasti mikroorganisma tahan asid alkohol (AAR). Nama prosedur mikrobiologi ini merujuk kepada pengarangnya: ahli bacteriologist Franz Ziehl dan ahli patologi Friedrich Neelsen.

Teknik ini adalah jenis perbezaan warna, yang membayangkan penggunaan pewarna yang berbeza untuk membuat perbezaan di antara struktur yang ingin anda perhatikan, membezakan dan kemudian mengenalpasti. Noda Ziehl-Neelsen digunakan untuk mengenal pasti beberapa jenis mikroorganisma.

Sebahagian daripada mikroorganisma ini adalah mikobakteria (contohnya, Mycobacterium tuberculosis), nocardias (sebagai contoh, Nocardia sp.) dan beberapa parasit uniselular (contohnya, Cryptosporidium parvum). Kebanyakan bakteria boleh diklasifikasikan melalui teknik biasa yang dipanggil Gram noda.

Walau bagaimanapun, sesetengah kumpulan bakteria memerlukan kaedah lain untuk mengenal pasti mereka. Teknik seperti pewarnaan Ziehl-Neelsen memerlukan gabungan pewarna dengan haba untuk menetapkan dinding sel pertama.

Kemudian datang proses perubahan warna yang membolehkan dua keputusan: rintangan atau kepekaan terhadap perubahan warna oleh asid dan alkohol.

Indeks

  • 1 Yayasan
    • Pewarna menengah
  • 2 Reagen
    • 2.1 Pewarna primer
    • 2.2 Decolorizing solution
    • 2.3 Pewarna menengah (anti pewarna)
  • 3 Teknik
    • 3.1 Prosedur pewarnaan asid cepat
  • 4 Rujukan

Yayasan

Asas teknik pewarnaan ini adalah berdasarkan sifat-sifat dinding sel mikroorganisma ini. Dinding terbentuk oleh sejenis asid lemak yang dipanggil asid miokolic; Ini dicirikan oleh rantaian yang sangat panjang.

Apabila asid lemak mempunyai struktur yang sangat panjang, mereka dapat mengekalkan pewarna lebih mudah. Sesetengah genera bakteria sangat sukar ditahan oleh noda Gram, kerana kandungan asid miokol tinggi pada dinding sel.

Dalam noda Ziehl-Neelsen, sebatian fenolik carbol fuchsin, pewarna asas digunakan. Ini mempunyai keupayaan untuk berinteraksi dengan asid lemak dinding sel, yang merupakan tekstur waxy pada suhu bilik.

Pewarnaan carbol fuchsin diperbaiki dengan kehadiran panas, kerana lilin mencair dan molekul pewarna bergerak lebih cepat ke dalam dinding sel.

Asid yang digunakan kemudiannya berfungsi untuk menghancurkan sel-sel yang tidak berwarna kerana dinding mereka tidak cukup berkaitan dengan pewarna; Oleh itu, kekuatan decolorizer asid mampu menghilangkan pewarna asid. Sel-sel yang menentang perubahan warna ini dipanggil asid tahan.

Pewarna sekunder

Selepas pemutihan sampel, ini berbeza dengan pewarna lain yang dipanggil pewarna sekunder. Hijau metilena atau hijau malachite biasanya digunakan.

Pewarna sekunder menampakkan bahan latar belakang dan, akibatnya, menghasilkan kontras dengan struktur yang dicelup di langkah pertama. Hanya sel-sel yang berubah-ubah menyerap pewarna kedua (anti-noda) dan mengambil warna mereka, manakala sel tahan asid mengekalkan warna merah.

Prosedur ini sering digunakan untuk mengenal pasti Mycobacterium tuberculosis dan Mycobacterium leprae, yang dipanggil bacilli asid cepat.

Reagen

Pewarna utama

Carboxin 0.3% fuchsin (ditapis) digunakan. Pewarna ini disediakan daripada campuran alkohol: fenol dalam etanol (90%) atau metanol (95%), dan dalam campuran ini 3 gram fuchsin asas dibubarkan.

Penyelesaian warna merah muda

Dalam langkah ini, anda boleh menggunakan larutan asid alkohol 3% atau 25% asid sulfurik.

Pewarna sekunder (anti pewarna)

Pewarna yang paling biasa digunakan untuk melakukan kontras dalam sampel biasanya 0.3% metilena biru. Walau bagaimanapun, yang lain juga boleh digunakan, seperti hijau malachite 0.5%.

Teknik

Prosedur pewarnaan asid cepat

Sediakan bakteria bakteria

Penyediaan ini dibuat pada slaid yang bersih dan kering, berikutan langkah berjaga-jaga kemandulan.

Mengeringkan smear

Benarkan smear kering pada suhu bilik.

Panaskan sampel

Sampel mesti dipanaskan dengan menggunakan api untuk slaid di bawah. Penetapan dengan alkohol boleh dilakukan apabila smear tidak disediakan dengan dahak (dirawat dengan natrium hipoklorit untuk memutihkannya) dan jika ia tidak akan dicelup dengan segera..

M. tuberculosis Ia dihapuskan dengan peluntur dan semasa proses pewarnaan. Thermofixing dari sputum yang tidak dirawat tidak akan membunuh M. tuberculosis, manakala fiksasi dengan alkohol adalah bakteria.

Tutup noda

Noda ditutup dengan larutan carbol fuchsin (noda asas utama).

Panaskan kotoran

Ini dilakukan selama 5 minit. Anda perlu notis pelepasan wap (kira-kira 60 ° C). Adalah penting untuk tidak terlalu panas dan mengelakkan membakar sampel.

Berkenaan dengan pemanasan noda, penjagaan yang baik harus diambil apabila pemanasan fuchsin carbol, terutama jika pewarnaan dilakukan di atas dulang atau bekas lain di mana bahan kimia yang mudah terbakar telah dikumpulkan dari noda terdahulu.

Hanya nyalaan kecil yang perlu diaplikasikan di bawah slaid menggunakan swab yang ringan sebelum dibasahi dengan beberapa titis alkohol asid, metanol atau 70% etanol. Elakkan menggunakan swab besar yang direndam dalam etanol kerana ini adalah bahaya kebakaran.

Basuh kotoran

Basuhan ini perlu dilakukan dengan air bersih. Sekiranya air paip tidak bersih, basuhlah cecair dengan disaring atau air suling, sebaik-baiknya.

Tutup smear dengan alkohol asid

Alkohol asid ini hendaklah pada 3%. Liputan dilakukan selama 5 minit atau sehingga smear cukup berubah-ubah, iaitu merah jambu pucat.

Ia mesti diambil kira bahawa alkohol asid mudah terbakar; Oleh itu, ia mesti digunakan dengan teliti. Elakkan berada berhampiran sumber pencucuhan.

Basuh kotoran

Basuh harus bersih dengan air suling.

Tutup smear dengan pewarna

Ia boleh menjadi malachite hijau (0.5%) atau metilena biru (0.3%) pewarna selama 1 atau 2 minit, menggunakan masa terpanjang jika smear itu nipis.

Basuh kotoran

Air bersih mesti digunakan semula (disuling).

Longkang

Belakang slaid harus dibersihkan dan noda hendaklah diletakkan di atas rak saliran, supaya ia kering (jangan gunakan kertas penyerap untuk pengeringan).

Periksa selesema dalam mikroskop

Objektif 100X dan minyak rendaman harus digunakan. Imbas smear secara sistematik dan tulis pemerhatian yang relevan.

Terangkan hasilnya

Secara teorinya, mikroorganisma yang dicelupkan warna kemerahan dianggap positif asid positif (AAR +).

Sebaliknya, jika mikroorganisma berwarna biru atau hijau, bergantung kepada pewarna yang digunakan sebagai pewarna, mereka dianggap sebagai asid tahan alkohol negatif (AAR-).

Rujukan

  1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Keperluan Mikrobiologi Praktikal (Ed ed.). Penerbit Perubatan Jaypee Brothers.
  2. Bauman, R. (2014). Mikrobiologi dengan Penyakit oleh Sistem Tubuh (edisi ke-4). Pearson Education, Inc.
  3. Warisan, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Pengenalan Mikrobiologi (Ed ed.). Cambridge University Press.
  4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). Manual Makmal dan Buku Kerja dalam Mikrobiologi: Permohonan untuk Penjagaan Pesakit (Edisi ke-11). Pendidikan McGraw-Hill.
  5. Vasanthakumari, R. (2007). Buku Teks Mikrobiologi (Ed ed.). B.I. Penerbitan PVT.